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摘要有研究报道，采用水电解产生的富氢气（H₂）透析液的血液透析（E - HD）可缓解透析相关疲劳，但其与代谢状况的关联仍不明确。81名接受标准血液透析（HD）的患者被分为3组 [A组（n = 25，30.9%）：伴有活动减少的疲劳—— 亚组A1：慢性持续性疲劳（n = 11），A2：仅在透析日出现疲劳（n = 14）；B组：无活动减少的疲劳（n = 24，29.6%）；C组（n = 32，39.5%）：无疲劳]，并对他们在接受E - HD治疗12个月后的疲劳状况、身体成分和代谢状况变化进行了研究。各组患者的基线特征无显著差异。在开始E - HD治疗后的12个月里，A组患者的疲劳感显著减轻，而B组和C组无变化。生物电阻抗分析显示，A1组无显著变化，但A2组尽管体重无显著变化，体脂却显著减少，骨骼肌量显著增加。富集分析表明，A组和C组在基线时，脂肪酸代谢、柠檬酸循环和糖酵解等代谢途径存在显著差异，而E - HD减轻了这些差异。E - HD可能通过改变患者的能量代谢来抑制透析相关疲劳。E - HD可能代表了一种超越传统基于溶质清除的透析疗法的尿毒症治疗新范式。
引言展开剩余95%疲劳被认为是透析患者一项关键的自我报告结果[1 - 3]。疲劳不仅影响日常活动，还因食欲和身体活动减少，被视为营养不良和虚弱的一个风险因素[4]。此外，疲劳已被确定为患者预后的一个独立预测因素[5 - 8]，这表明疲劳症状可能形成一个有害的循环。因此，了解透析相关疲劳的病理生理学机制并制定有效的治疗策略，是医学上面临的重大挑战。
临床上，疲劳症状可能在血液透析（HD）开始时出现，主观症状大多局限于透析日，也可能无论是否透析都持续存在[8]。然而，目前尚不清楚它们是否属于不同的情况。关于透析疲劳的病理生理学存在许多不确定性。尿毒症、营养、贫血和日用品等因素[9]，以及HD系统相关问题，如生物相容性相关的氧化应激[10 - 11]，包括铁剂的使用[12]，都可能导致疲劳的发生。血液透析系统中的生物相容性问题仍未得到解决。血液与透析设备的接触会刺激白细胞、血小板和补体激活，导致炎症细胞因子释放、血小板聚集、中性粒细胞脱颗粒（如髓过氧化物酶释放）和中性粒细胞胞外陷阱的形成[13 - 15]。目前，尚无能够完全抑制这些反应的治疗系统。
氢气（H₂）具有生物效应，如清除线粒体中的活性氧，并通过主要的氧化还原调节因子NF - E2相关因子2（Nrf2）激活广泛的抗炎和抗氧化系统[16 - 23]。基于H₂的抗氧化和抗炎特性，我们开发了电解水血液透析（E - HD），即在透析液中添加H₂以提高生物相容性[24 - 26]。研究表明，E - HD可降低HD治疗期间的氧化应激[27]，并通过持续治疗纠正患者的基础氧化还原状态[28]。此外，我们的研究团队已独立报道，接受E - HD治疗的患者疲劳感得到缓解[29 - 32]。这些观察结果表明，生物相容性对透析相关疲劳发展的影响可能很大。然而，通过H₂改善生物相容性从而在临床上抑制疲劳的机制仍知之甚少。
因此，本研究旨在对E - HD治疗期间的疲劳进行长期评估，并从身体代谢的角度研究疲劳的变化及其机制。
结果1. 疲劳评估及按疲劳程度对患者分组（图1）
图1 标准血液透析 M0 的患者分组。
- 通过对受试者工作特征（ROC）曲线的分析，确定数字评分量表（NRS）评分≥4为存在明显疲劳的临界值，在本研究中，透析日原始疲劳量表3级或4级被定义为伴有日常生活活动（ADL）减少的疲劳（NRS = 3.75：敏感性0.909，特异性0.764；NRS = 4.5：敏感性0.909，特异性0.833）。同样，NRS = 0或1在本研究中被定义为无疲劳（NRS = 1.5：敏感性0.936，特异性0.806；NRS = 2.25：敏感性0.851，特异性0.861对应1级）。根据结果，患者被分为3组：A组（NRS为4或更高定义为伴有ADL减少的疲劳：n = 25，30.9%），B组（NRS为2或3定义为无ADL减少的疲劳：n = 24，29.6%），C组（NRS为0或1定义为无疲劳：n = 32，39.5%）。此外，A组又细分为两种类型：A1组，透析日和非透析日均有慢性持续性疲劳（NRS 4或更高）（n = 11）；A2组，仅在透析日有疲劳（n = 14）。
2. 基线时按疲劳程度划分的患者人口统计学特征及12个月观察期内疲劳水平的变化
- 96名患者中有92例获得了本研究的知情同意，此后对他们进行了12个月的随访。在此期间，6名患者因就医便利转至其他诊所，2名患者因严重肺炎死亡（1例为新冠病毒感染，1例为社区获得性肺炎），3名患者因在研究期间对问卷反馈不佳而退出（1例因长期住院，2例因不配合调查）。最终，81例患者完成了12个月的调查。对这81名患者的数据进行分析（男性60例；74.1%，平均年龄71.4岁，平均透析时长10.6年）。
- 各组患者的特征见表1。3组患者在透析日NRS、非透析日NRS、年龄方面存在显著差异，其他方面未发现显著差异。
- 通过游离DNA（cfDNA）和髓过氧化物酶与DNA复合物（MPO - DNA）水平来研究作为生物相容性标志物的中性粒细胞胞外陷阱（NETosis）现象，但在基线（表1）或随访6个月、12个月时，各组均未发现显著差异；A组cfDNA（单位）：6个月时为3.70 ± 0.75，12个月时为3.83 ± 0.91；B组6个月时为3.46 ± 0.90，12个月时为3.57 ± 0.95；C组6个月时为3.67 ± 0.99，12个月时为3.72 ± 1.11。A组MPO - DNA（单位）：6个月时为2.86 ± 1.89，12个月时为2.82 ± 1.74；B组6个月时为2.59 ± 1.23，12个月时为3.01 ± 1.49；C组6个月时为2.44 ± 1.10，12个月时为2.64 ± 1.31。
表 1 基线（第 0 个月）按疲劳等级划分的患者特征。
表 2 A 组亚组的患者特征：基线（第 0 个月）和观察结束（第 12 个月）。
- 表2显示了A组亚组患者的特征。A1和A2在基线（M0）时骨骼肌量存在显著差异，A2在M0和M12之间的脂肪量、骨骼肌量和细胞外液与总体液百分比（ECV/TBW%）存在显著差异。
图2 12个月内透析日和非透析日NRS的变化。
- 图2a和图2b分别显示了12个月内透析日和非透析日NRS的变化。A组透析日NRS显著下降，而非透析日未观察到统计学变化。B组和C组在透析日和非透析日均未发现显著变化。
- 关于A1组和A2组，与M0基线相比，A1组和A2组在M12时透析日和非透析日的NRS均显著下降。除A1组骨骼肌量显著较低外，基线参数无其他差异。在M12时，与M0相比，A2组脂肪量显著减少，骨骼肌量显著增加，其他参数无显著变化。
- A组NRS的统计结果存在差异（即通过重复测量方差分析，A组非透析日从M0到M12的NRS无统计学差异，而通过配对t检验，A1和A2亚组M0和M12之间NRS显著下降）。关于原因，我们认为样本量小以及A2组M12数据的非正态分布（存在异常值）可能导致了这一令人困惑的结果。A组（A1和A2）的亚组分析呈现出与图2b相同的趋势。
3. 用于代谢组分析的患者样本集及尿毒症毒素的测量（图3）
- 对从A组和C组抽取的35名患者进行代谢组分析和尿毒症毒素测量，以比较疲劳患者和非疲劳患者之间，以及标准HD（S - HD）的M0和E - HD的M12之间的差异。对于患者样本集，S - HD（M0）时的疲劳组和非疲劳组定义为“疲劳 - S（FS）”，E - HD（M12）时定义为“疲劳 - E（FE）”，所有患者在S - HD（M0）和E - HD（M12）之间的比较定义为“EHD”。各样本集患者数量详情见图3。
图3各样本集患者数量.
图4 .170种个体代谢物概述。
4. 综合代谢组学分析及E - HD对透析疲劳的可能影响
- 通过非靶向代谢组学分析检测到170种个体代谢物，富集代谢物集（前25位）的概述分别见图4a（患者样本集：FS）、图5a（患者样本集：EHD）和图6a（患者样本集：FE）。各组间几种代谢物存在显著变化。3个患者样本集中每种代谢物的显著变化详情分别见图4b、图5b和图6b。
图5各种代谢物的显著变化
图6各种代谢物的显著变化
- 图7显示了各患者样本集富集代谢物集之间相互关系的总结。FS和EHD有16个共同的代谢物集，FS和FE有12个共同的代谢物集。在FS和EHD的共同代谢物集中，8个代谢物集与不与FE重叠的代谢物相同（途径A），8个与FS和FE相同（途径B）。图8展示了E - HD改变的代谢途径关键候选者的示意图。
图7各患者样本集富集代谢物集之间相互关系。
图8展示了E - HD改变的代谢途径关键候选者的示意图。
5. 尿毒症毒素浓度（表3、表4）
- 基线（M0）时，疲劳组和非疲劳组血清中尿毒症毒素浓度无显著差异（患者样本集：FS）。在M0和M12的总体比较中（患者样本集：EHD），马尿酸、对甲酚硫酸盐、乙二醛和3 - 脱氧葡萄糖醛酮无显著变化，而M12时硫酸吲哚酚和甲基乙二醛显著下降。
讨论已有研究报道E - HD可改善透析相关疲劳[29 - 32]。本研究评估了疲劳的长期变化，并在引入E - HD后研究了代谢状况和尿毒症毒素，以探索其抗疲劳作用背后的机制。在标准HD期间经历伴有活动减少的疲劳的患者，在12个月内疲劳感显著改善。其中，仅在透析日出现疲劳的患者，体脂肪量显著减少，而骨骼肌量显著增加。代谢组分析显示，基线时疲劳组和非疲劳组在能量代谢方面存在显著差异，12个月时E - HD减轻了这些差异。两组在基线时尿毒症毒素谱无显著差异，但E - HD 12个月后硫酸吲哚酚和甲基乙二醛水平显著下降。
在本研究中，我们基于临床上它们可能是不同情况的假设，将A组患者分为两个亚组，即在透析日和非透析日均有持续性疲劳的患者（A1组），以及仅在透析日有疲劳的患者（A2组）。
两组之间，基础疲劳水平和基础骨骼肌量存在差异。此外，两组间身体成分的变化（即M0与M12的脂肪量、骨骼肌量和ECV/TBW）也不同。这些数据可能支持我们的观点。然而，两组在M12时与M0相比，透析日疲劳均显著下降。此外，A1组非透析日疲劳显著下降（M0与M12相比），A1组和A2组在M12时无统计学差异。基于这些结果，我们推测E - HD可能抑制了与HD相关的疲劳病理因素，从而改善了A1组过度的疲劳。这些结果可能表明两组之间存在共同的病理机制。综合这些结果，我们假设的有效性仍有待验证，需要进一步研究来得出结论。
透析患者疲劳的病理生理学在很大程度上仍不清楚。在本研究中，我们根据NRS疲劳水平将HD患者分为3组。关于患者特征，疲劳患者（A组）年龄较大，女性居多。但除此之外，在医学背景、身体成分和实验室数据（如血红蛋白、血清白蛋白和C反应蛋白）方面未发现差异。通过cfDNA和MPO - DNA水平研究作为生物相容性标志物的中性粒细胞胞外陷阱现象，但在基线或随访期间未发现显著差异。然而，代谢组分析结果表明，基线（M0）时疲劳组和非疲劳组（患者样本集：FS）在代谢谱方面存在显著差异，包括能量代谢途径。与非疲劳组相比，疲劳组脂肪酸代谢和糖酵解相对增强，而在柠檬酸循环中，尽管柠檬酸和异柠檬酸水平较高，但琥珀酸显著降低，表明异柠檬酸之后的代谢存在阻断。这表明能量代谢的潜在紊乱可能与透析相关疲劳有关。有趣的是，在伴有疲劳和疲惫的疾病中，如肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征[33 - 34]、系统性红斑狼疮[35]、法布里病[36]和癌症[37]，均有能量代谢紊乱的报道。透析患者的疲劳可能与这些疾病存在病理同源性。
从S - HD转换为E - HD后，先前研究报道了自主神经平衡的恢复[30]、氧化应激的抑制以及抗氧化剂耗竭的预防[31]。本研究表明，在S - HD和E - HD时，疲劳组和非疲劳组的代谢谱存在差异，此外，S - HD和E - HD之间也存在差异（图4a、图5a和图6a）。
如图7总结，根据富集分析结果，我们推测了4个可能影响疲劳发展的途径组，即被E - HD纠正的疲劳相关因素（途径A）、可能受E - HD影响的因素（途径B）、不受E - HD影响的疲劳病理常见事件（途径C）以及完全不受E - HD影响的因素（途径D）。被E - HD纠正的途径A包括能量代谢，如脂肪酸合成/降解、糖酵解/糖异生和二羧酸代谢——可能涉及多元醇途径。另一方面，柠檬酸循环被认为是一个可能受E - HD影响但未得到充分纠正的疲劳相关因素（途径B）。基于这些结果，我们推测E - HD可通过干扰糖酵解、脂肪酸代谢和柠檬酸循环来改善透析相关疲劳。图8总结了可能被E - HD改变的中心代谢途径；在S - HD中相对增强的代谢途径，即糖酵解和脂肪酸代谢，在E - HD中可能受到抑制，而在S - HD中相对抑制的柠檬酸循环，在E - HD中可能得到改善。此外，与S - HD相比，E - HD中谷胱甘肽合成可能更易进行。
关于柠檬酸循环功能障碍，似乎琥珀酸前体琥珀酰辅酶A和α - 酮戊二酸的形成不足可能与该机制有关（图8）。对于前者，不能排除肠道微生物群产生的短链脂肪酸丙酸供应不足可能参与其中。在S - HD和E - HD的比较中（患者样本集：EHD），丙酸代谢存在显著差异，且在E - HD中观察到源自α - 酮戊二酸的脯氨酸和鸟氨酸水平较高，这表明E - HD恢复了柠檬酸循环功能。此外，在E - HD时疲劳组和非疲劳组的比较中（患者样本集：FE），糖酵解和脂肪酸代谢未被确定为显著因素。综合这些结果，关于透析相关疲劳的机制，我们推测如其他地方所报道[38]，在 mitochondrial 功能受损的状态下，糖酵解和脂肪酸合成可能至少部分增强，作为ATP生成的补偿机制。我们推测E - HD可能影响了疲劳患者的线粒体功能，因为大量报告表明H₂通过部分抑制氧化应激对线粒体具有保护作用[39 - 40]。最近有报道称棕榈酸通过线粒体损伤在脂毒性心肌细胞损伤中起核心作用[41]。有趣的是，在本研究中，S - HD疲劳组中观察到棕榈酸显著增加，而E - HD使其改善，这可能表明E - HD如其他地方所报道[42]，对心脏具有保护作用。
此外，与M0相比，M12时焦谷氨酸的减少可能表明引入E - HD后谷胱甘肽代谢的恢复。这可能意味着E - HD可以提高抗氧化能力或减少氧化应激刺激，防止抗氧化剂耗竭，如其他地方所报道[27, 30]。改善的能量代谢和抗氧化能力可能有助于临床疲劳的减轻，同时A2组出现营养改善，即引入E - HD后肌肉量增加，这表明患者从分解代谢环境转变为合成代谢状态。然而，这些过程之间的相互关系仍然是假设性的，理解这种病理生理学仍是未来的一个挑战。
有趣的是，在E - HD（患者组：FE）中，疲劳组和非疲劳组之间的富集代谢物集与S - HD（患者组：FS）时不同，并且发现了包括营养元素相关的因素，如牛磺酸和支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸）的代谢。我们推测，在E - HD改善能量和氧化还原状态后，这些与疲劳相关的因素才得以显现。关于营养问题，有研究报道，血液透析（HD）患者血浆中的支链氨基酸水平低于健康受试者 ，同时其水平与HD患者的疲劳程度呈正相关 。在本分析中，无论采用何种HD方式，疲劳组中的缬氨酸和亮氨酸水平往往较高，这可能反映出由于肌肉量减少，疲劳患者体内支链氨基酸的肌肉代谢延迟 。牛磺酸是一种具有抗氧化特性的非必需氨基酸，可从海鲜等膳食来源中吸收。据报道，其在HD患者体内的较高水平与较低的疲劳程度相关 。基于该报道和本研究结果，验证疲劳患者是否能从包括补充牛磺酸在内的营养支持中获益，是一项临床挑战。
在基线时（患者组：FS），疲劳患者和非疲劳患者的尿毒症毒素谱未发现差异。然而，对所有患者进行比较后发现，硫酸吲哚酚和甲基乙二醛这两种氧化应激诱导物 在E - HD治疗12个月后显著减少。
硫酸吲哚酚由肠道内色氨酸代谢产生，随后在肝脏中进一步代谢，它是一种与蛋白质结合的尿毒症毒素，难以通过透析清除 。因此，E - HD能显著降低该分子的水平，这在临床上值得关注。由于色氨酸及其肠道代谢产物色胺和吲哚乙酸的水平保持不变（数据未显示），对于硫酸吲哚酚的减少，可能存在几种机制，即抑制肠道细胞中吲哚的产生、减少体内硫酸吲哚酚的生成，或者如其他研究所示，E - HD增加了其清除率 。考虑到E - HD可能改变肠道微生物群产生短链脂肪酸（丙酸）的情况，HD过程中的H₂负荷是否会影响菌群失调，仍是未来研究的一个课题。
甲基乙二醛是在糖酵解和多元醇途径增强过程中产生的一种尿毒症毒素，会诱导氧化应激 。近期报告表明，甲基乙二醛可导致肌肉祖细胞中的线粒体损伤，进而引发尿毒症肌少症 。疲劳组骨骼肌量有降低的趋势，这凸显了甲基乙二醛减少的临床意义。
本研究存在一些局限性，包括采用单臂观察性设计，对代谢组分析的解释是基于假设而非直接数据，并且无法排除研究期间外部因素或患者内部标准变化对疲劳评估的影响。此外，由于病例数量有限，本研究无法详细评估A1组和A2组之间的差异，我们认为在慢性疲劳类型中，心理因素可能会产生影响 。
尽管如此，我们认为本研究表明E - HD可能通过影响能量代谢以及潜在的抗氧化代谢来缓解疲劳。然而，E - HD影响这些代谢系统的确切机制仍不清楚。近期研究表明，H₂可直接影响线粒体功能 ，并诱导Nrf2表达 ，从而调节机体的氧化还原系统。探究电解水中所含的H₂是否通过激活Nrf2来改善线粒体功能并增强整体抗氧化系统，仍是未来的一项关键挑战。
总之，E - HD似乎能够抑制透析相关疲劳。其机制可能涉及能量代谢和抗氧化系统的改变，以及与氧化应激相关的尿毒症毒素的减少。E - HD作为一种新型的尿毒症治疗方法，通过调节机体代谢，超越了传统基于溶质清除的透析疗法。
方法患者
本前瞻性观察研究的参与者为2020年10月至2021年9月期间在日本东京圣路加国际医院门诊接受常规透析治疗的患者。所有患者均定期接受标准HD治疗，每周三次，每次4 - 5小时，使用高性能膜透析器（膜材料：聚砜、聚醚砜、聚甲基丙烯酸甲酯和三醋酸纤维素）。自2020年10月第一周起，门诊所有患者开始接受E - HD治疗，并在此后定期进行。转换为E - HD治疗无任何禁忌症，除透析液改变外，透析方案无任何变化。邀请所有门诊HD患者（n = 96）参与本研究。96名患者中有92例获得了本研究的知情同意，此后对他们进行12个月的随访。在此期间，6名患者因就医便利转至其他诊所，2名患者因严重肺炎死亡（1例为COVID - 19感染，1例为社区获得性肺炎），3名患者因在研究期间对问卷反馈不佳而退出（1例因长期住院，2例因不配合调查）。最终，81例患者完成了12个月的调查。对这81名患者（60名男性；占74.1%，平均年龄71.4岁，平均HD透析时长10.6年）的数据进行分析。
本研究方案已获得圣路加国际医院伦理审查委员会的全面批准（批准日期：2019年6月19日；研究编号：18 - RZ013）。所有方法均按照相关指南和规定执行。
疲劳评估
如其他文献报道 ，本研究使用数字评分量表（NRS）和我们自行设计的原始疲劳量表对患者疲劳进行评估。所有问卷均采用书面形式。NRS是一种一维量表，左端表示“完全不累（0）”，右端表示“极度疲惫（10）”。我们的原始疲劳量表是患者的四级自我评估量表：1级（无疲劳），患者行动如常，无任何疲劳感；2级（轻度疲劳），患者行动如常，但感觉疲劳；3级（中度疲劳），患者即使从事轻度工作也会感到疲劳；4级（重度疲劳），患者感觉非常疲劳并入睡。因此，预计1级和2级患者的日常生活活动（ADL）能够维持，而3级和4级患者的ADL会大幅下降。
所有患者在标准HD期间的第一个时间点，即在开始EHD系统前2周内（M0），使用问卷进行疲劳评估，问卷问题为“你在之前的透析日以及透析后第二天感觉有多疲劳？”。在开始E - HD系统后的第1个月（M1）、第3个月（M3）、第6个月（M6）和第12个月（M12），反复询问NRS（透析日和非透析日）。在每个时间段的特定一周内，随机选择一个透析日，在HD开始前进行疲劳评估。
E - HD系统概述
简而言之，E - HD溶液的制备过程如下：自来水供应至电解水 - 血液透析系统（日本大阪Trim Medical Institute Co.），在该系统中，水经过活性炭过滤和软化处理，然后通过向阳极和阴极电极板供应直流电进行电解。阳极一侧的水被排出，阴极一侧的水（电解水）被收集起来供应给反渗透模块。电解强度被调整至目标H₂浓度。由电解水 - 血液透析系统产生的含H₂反渗透水被用于制备HD溶液。流入的E - HD溶液成分与CHD使用的透析溶液相同，不同之处在于E - HD中含有溶解的H₂，而电解质水平或pH值无差异。透析液中的H₂水平在70 - 130 ppb范围内。使用DH Meter（DH - 35A；日本东京DKK - TOA公司）测量HD溶液中溶解的H₂量。
测量
在基线期（M0）以及研究期间的测试点（1个月（M1）、3个月（3M）、6个月（6M）、12个月（12M）），在HD治疗前后从所有患者处采集血样。采样前患者可正常进食。血样用乙二胺四乙酸离心处理，所有样本均储存于 - 80℃，直至需要测量时取出。
对M0和M12的血浆样本（A1组，n = 11；A2组，n = 12，C组，n = 12）进行尿毒症毒素和羰基化合物的测量以及代谢组分析。在A2组中，有2例因样本不足未进行测量，在C组中，从32例中随机选择12个样本。
NETosis的标志物
直接在生物体液中检测游离DNA。首先将SYBR Gold核酸凝胶染色剂（美国Invitrogen公司）在二甲基亚砜（美国Sigma - Aldrich公司）中按1:1000稀释，然后在磷酸盐缓冲盐水（以色列Beth Haemek的Biological Industries公司）中按1:8稀释。将20 μL DNA标准溶液（美国Sigma - Aldrich公司）和测试样品分别加入黑色96孔板（德国Greiner Bio - One公司）中。向每个孔中加入40 μL上述制备的SYBR Gold溶液（最终稀释度1:10,000），使用96孔荧光计（美国PerkinElmer公司）在发射波长535 nm和激发波长485 nm下测量荧光。
为检测NET，参考Lood的报告 进行以下步骤以测量髓过氧化物酶（MPO）和DNA复合物（MPO - DNA）。将96孔微量滴定板（Corning公司）用小鼠单克隆抗MPO抗体（4 μg/ml，Biorad公司，克隆4A4）在4℃下包被过夜，然后用1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水在室温下封闭2小时。封闭后，加入血浆样本（10%）并在4℃下孵育过夜。为进行检测，加入抗双链DNA - 辣根过氧化物酶抗体（稀释1/100，Roche Diagnostics公司），在室温下孵育2小时。用3,3′,5,5′ - 四甲基联苯胺（BD Biosciences公司）显色反应，加入2 N硫酸终止反应。使用酶标仪（Synergy，BioTek公司）在450 nm处测量吸光度。分离的NETs用作标准曲线，1 U/ml相当于10,000个中性粒细胞释放的NET。
血浆代谢物
采用基于代谢组学方法的气相色谱 - 质谱联用仪（GC - MS）测量血浆代谢物水平。将50 μL血浆与250 μL含有55%甲醇和22%氯仿的溶液混合，该溶液溶解于含有0.5 mg/mL 2 - 异丙基苹果酸（美国Sigma - Aldrich公司）的蒸馏水中。然后，将样品在ThermoMixer C（Eppendorf公司）中于37℃、1200 rpm振荡孵育30分钟。样品在4℃、16,000 × g下离心3分钟。收集200 μL上清液，并加入200 μL蒸馏水。样品在4℃、16,000 × g下再次离心3分钟。取250 μL上清液，使用蒸发器在减压下干燥并冻干。将80 μL溶解于吡啶中的20 mg/mL甲氧胺盐酸盐（美国Sigma - Aldrich公司）与冻干样品混合，超声处理20分钟，并在30℃、1200 rpm下振荡90分钟。接下来，加入40 μL N - 甲基 - N - 三甲基硅基 - 三氟乙酰胺（MSTFA）（日本东京GL Sciences公司）进行衍生化。混合物在37℃、1200 rpm下混合30分钟，在4℃、16,000 × g下离心5分钟，取1 μL所得上清液进行GC - MS分析。GC - MS分析使用GC - MS QP2010 Ultra（日本岛津公司），配备熔融石英毛细管柱（BPX - 5；30 m × 0.25 mm内径，膜厚：0.25 μm；日本岛津公司），进样口前端温度为250℃，氦气通过柱子的流速为39.0 cm/秒。柱温在60℃保持2分钟，然后以15℃/分钟的速度升至330℃，并保持3分钟。接口和离子源温度分别为280℃和200℃。所有数据通过GC - MS分析获得。使用Smart Metabolites Database（日本岛津公司）中指示的保留时间。为进行半定量评估，计算每个定量离子的峰面积，并使用2 - 异丙基苹果酸峰面积进行归一化。
尿毒症毒素
为测量尿毒症毒素进行样品制备时，将75 μL含有1.25 μg/mL硫酸吲哚酚 - d3和2.5 μg/mL马尿酸 - d5的0.1%甲酸甲醇加入到25 μL每份血浆中，涡旋数秒。然后，样品超声处理5分钟，并在4℃、16,400 × g下离心20分钟。上清液通过0.2 μm Duo - filter膜（日本京都YMC Co., Ltd.公司）过滤。使用与TSQ Quantum Ultra质谱仪联用的Nanospace SI - 2 3033，以负离子模式通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）对硫酸吲哚酚和马尿酸进行定量分析。对于硫酸吲哚酚和马尿酸的测量，每个样品（1 μL）注入100 × 2.0 mm CAPCELL PAK C18 MG III，3 - μm柱（日本大阪OOSAKA SODA公司），配备Scherzo SM - C18保护柱5 × 2.0 mm（日本京都Imtakt Corporation公司），流速为0.2 mL/分钟。对于梯度洗脱，流动相A为纯水中10 mM醋酸铵，流动相B为乙腈。线性和逐步梯度程序如下：0 - 8分钟：0 - 100%溶剂B；8 - 12分钟：100%溶剂B；12 - 15分钟：0%溶剂B。通过MS/MS在选择反应监测（SRM）模式下进行定量分析，监测前体离子到产物离子的转变和碰撞能量：硫酸吲哚酚的m/z 212 → 80，21 V；硫酸吲哚酚 - d4的m/z 216 → 80，30 V；马尿酸的m/z 178 → 134，13 V；马尿酸 - d5的m/z 183 → 139，27 V；对甲酚硫酸盐的m/z 187 → 107，23 V。喷雾电压为2500 V，汽化器温度为450℃，毛细管温度为220℃。
身体成分和认知功能
在M0和M12的血液透析程序结束20分钟后，所有患者采用仰卧位，使用Seca®医用身体成分分析仪525（德国汉堡Seca GmbH & Co. KG公司）进行生物电阻抗分析。通过生物电阻抗分析评估的参数包括脂肪量、骨骼肌量、细胞外液（ECW）和总体液（TBW） 。在M0和M12对所有患者进行简易精神状态检查表（MMSE）检查。
分析变量根据情况以平均值 ± 标准差（SD）或百分比（%）表示。统计学显著性设定为P < 0.05。组间比较采用配对t检验、非参数Wilcoxon符号秩检验和卡方检验。时间进程分析采用重复测量方差分析和Bonferroni法进行多重比较。使用SPSS 22.0版（美国纽约州阿蒙克市IBM公司）进行统计分析，使用JMP Pro软件16.0.0版（美国北卡罗来纳州卡里市SAS Institute Inc.公司）进行GC - MS测量分析。
在代谢组学中，代谢物集富集分析用于识别与感兴趣的表型（如疲劳的存在）相关的改变的代谢物集（代谢途径），使用的算法基于公共数据库（在本研究中为京都基因与基因组百科全书（KEGG））构建的通用代谢物网络运行 。
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发布于：上海市